Bộ lên men tùy chỉnh là gì? Các tùy chọn thiết kế, vật liệu & điều khiển

Bộ lên men tùy chỉnh là gì, và tùy chỉnh khác nhau như thế nào đối với nuôi cấy tế bào so với nhiệm vụ vi sinh vật? Một bộ lên men tùy chỉnh cho nuôi cấy tế bào được thiết kế dựa trên bốn ràng buộc hầu như không quan trọng trong quá trình lên men vi sinh vật: độ nhạy cắt cực cao, nhu cầu oxy thấp trên một đơn vị thể tích, kiểm soát sinh lý chặt chẽ và tính toàn vẹn dữ liệu hoàn chỉnh. Tế bào động vật có vú bị tổn thương ở tốc độ đầu cánh quạt trên khoảng 1,5 m/s, vì vậy các bình chứa sử dụng cánh quạt thủy lực hướng trục đường kính lớn với công suất đầu vào 0,01-0,10 kW/m3 thay vì 0,5-5 kW/m3 điển hình của dịch vụ vi sinh vật. Oxy hòa tan được giữ ở mức 20-50% độ bão hòa không khí, pH ở mức 6,8-7,4 trong phạm vi ±0,05, nhiệt độ ở mức 36,5-37,0°C và CO2 hòa tan dưới 100-150 mmHg.

1. Các tùy chọn thiết kế cho nuôi cấy mật độ cao và nhạy cảm với cắt

Tùy chỉnh cho nuôi cấy tế bào tập trung vào bốn hệ thống con. Mỗi hệ thống có một mục tiêu có thể đo lường và một chế độ lỗi được xác định:

• Khuấy và truyền khí có độ cắt thấp: Lựa chọn cánh quạt chiếm ưu thế. Cánh quạt thủy lực hướng trục đường kính lớn hoặc cánh quạt hàng hải ở tỷ lệ D/T từ 0,40-0,50 cung cấp khả năng trộn khối ở tốc độ đầu cánh quạt 0,5-1,5 m/s, so với 3-7 m/s mà vi khuẩn và nấm men có thể chịu được. Do nhu cầu oxy thấp hơn, thường là 0,5-2 mmol O2/L·h thay vì 50-150, bộ phân phối vòng ở mức 0,01-0,10 vvm là đủ, và tổn thương tế bào do bong bóng ở giao diện khí-lỏng trở thành cơ chế giới hạn thay vì cắt khối. Việc bổ sung 0,5-2,0 g/L Pluronic F-68 bảo vệ tế bào khỏi vỡ bong bóng, và sử dụng bộ phân phối lỗ khoan thay vì bộ phân phối đã thiêu kết giữ cho kích thước bong bóng đủ lớn để giảm cắt giao diện.
• Hoàn thiện bề mặt và vật liệu: Các bình nuôi cấy tế bào được chế tạo từ thép không gỉ 316L với hàm lượng carbon thấp và lưu huỳnh được kiểm soát, được đánh bóng cơ học và đánh bóng điện đến Ra 0,4 μm hoặc thấp hơn theo tiêu chuẩn ASME-BPE SF4 hoặc tốt hơn. Đánh bóng điện có ý nghĩa ở đây vì hai lý do ngoài khả năng làm sạch: nó loại bỏ các khe vi mô nơi mycoplasma và bacteriophage có thể tồn tại giữa các đợt sản xuất, và nó tạo ra một lớp thụ động giàu crom chống lại các chu kỳ kiềm và axit lặp đi lặp lại của một cơ sở đa sản phẩm. Khi sử dụng các nguồn cấp liệu chứa clorua hoặc môi trường có độ mặn cao, thép duplex 2205 hoặc 904L được thay thế, và tất cả các chất đàn hồi phải đạt tiêu chuẩn USP Class VI và không chứa thành phần có nguồn gốc từ động vật.
• Tuần hoàn và giữ tế bào: Các quy trình mật độ cao vượt xa fed-batch bằng cách thu hoạch liên tục trong khi giữ lại tế bào. Một bộ lên men tuần hoàn tùy chỉnh tích hợp một vòng lọc dòng tiếp tuyến xen kẽ hoặc dòng tiếp tuyến với một thiết bị giữ có định mức cho toàn bộ tốc độ thu hoạch. Tốc độ tuần hoàn cụ thể thường là 0,02-0,10 nL/tế bào/ngày, tương đương với 1-3 thể tích bình mỗi ngày, duy trì mật độ tế bào sống 20-80 x 10^6 tế bào/mL với khả năng sống trên 90%. Bình chứa yêu cầu các đầu nối bổ sung cho vòng giữ, một bơm thu hoạch có đầu bơm cắt thấp và logic điều khiển duy trì trọng lượng bình không đổi trong khi sản phẩm được rút ra.
• Quản lý CO2 hòa tan: Ở mật độ tế bào cao, carbon dioxide hòa tan tích tụ và ức chế sự phát triển và glycosyl hóa trên khoảng 100-150 mmHg. Tùy chỉnh giải quyết vấn đề này thông qua tốc độ sục khí cao hơn của không khí hoặc oxy ở đáy bình để loại bỏ CO2, khoảng trống đáy tăng lên làm tăng thời gian lưu khí, hoặc một vòng ngoài với bộ tiếp xúc màng. Vì việc tăng cường khuấy đơn giản sẽ làm tăng cắt, phản ứng chính xác thường là tăng khí ở tốc độ khuấy thấp hơn, đây là một quyết định thiết kế phải được đưa ra khi hình dạng bình đã cố định chứ không phải trong quá trình vận hành.

2. Kiến trúc điều khiển và tuân thủ

Đối với các sản phẩm được quản lý, hệ thống điều khiển là một sản phẩm bàn giao tuân thủ không kém gì bình chứa. Ba lớp xác định nó:

• Thiết bị đo lường và PAT: Các vòng lặp tiêu chuẩn bao gồm nhiệt độ, pH, DO, áp suất, mức, và lưu lượng khí, với điều khiển DO theo tầng thông qua khuấy, sau đó là lưu lượng khí, sau đó là làm giàu oxy. Các cài đặt nâng cao bổ sung phép đo điện dung cho thể tích tế bào sống trực tuyến, quang phổ Raman cho glucose, lactate, glutamate và hiệu suất, và phân tích khí thải cho OUR và CTR. Các công cụ công nghệ phân tích quy trình này hỗ trợ kiểm tra giải phóng theo thời gian thực theo khuôn khổ QbD được định nghĩa trong ICH Q8 đến Q11, và chúng chuyển việc kiểm soát từ các điểm đặt cố định sang cấp liệu dựa trên mô hình thích ứng với trạng thái trao đổi chất thực tế của nuôi cấy.
• Cấu trúc công thức và tính toàn vẹn dữ liệu: Phần mềm điều khiển nên tuân theo ISA-88, tách biệt công thức chung, công thức theo địa điểm, công thức chính và công thức điều khiển để một quy trình được xác định ở quy mô phòng thí nghiệm có thể chuyển sang sản xuất mà không cần viết lại logic. Đối với sản xuất GMP tại Hoa Kỳ, 21 CFR Phần 11 yêu cầu phần mềm được xác nhận với các dấu vết kiểm toán an toàn, được tạo bằng máy tính, có dấu thời gian, kiểm tra quyền thông qua truy cập dựa trên vai trò và chữ ký điện tử được liên kết với hồ sơ của họ. Tại Liên minh Châu Âu, Phụ lục 11 áp đặt các yêu cầu tương đương, và cả hai đều yêu cầu hệ thống phải được xác nhận chính thức với các thử nghiệm có tài liệu đối chiếu với một đặc tả bằng văn bản.
• Sử dụng một lần so với Hybrid thép không gỉ: Tùy chỉnh ngày càng có nghĩa là chọn nơi đặt ranh giới giữa vật liệu tái sử dụng và vật liệu dùng một lần. Một cơ sở hybrid giữ bình thép không gỉ cho bộ lên men sản xuất trong khi sử dụng túi dùng một lần để chuẩn bị môi trường, giữ đệm và thu hoạch, điều này loại bỏ gánh nặng xác nhận làm sạch lớn nhất trong khi vẫn giữ được khả năng chịu áp suất và truyền nhiệt của thép. Các dây chuyền hoàn toàn dùng một lần phù hợp với sản xuất đa sản phẩm lâm sàng dưới 2.000 L. Lựa chọn nên dựa trên số lượng đợt sản xuất và tần suất thay đổi: trên khoảng tám đến mười lần thay đổi sản phẩm mỗi năm, sử dụng một lần thường thắng về tổng chi phí hàng hóa.

Ưu tiên bộ lên men tùy chỉnh theo loại tế bào

Câu hỏi thường gặp (FAQ)

H: Sự khác biệt giữa bộ lên men tùy chỉnh và bộ lên men tùy chỉnh là gì?

A: Trên thực tế, sự khác biệt là dải dung sai và gánh nặng tài liệu. Một bộ lên men tùy chỉnh để sản xuất bia, ethanol hoặc enzyme được tối ưu hóa cho thông lượng, khả năng làm sạch và chi phí vốn, với bề mặt hoàn thiện khoảng Ra 0,8 μm, phớt cơ khí và thiết bị đo lường công nghiệp. Một bộ lên men tùy chỉnh cho nuôi cấy tế bào động vật có vú hoặc tế bào gốc được tối ưu hóa cho kiểm soát sinh lý và tính toàn vẹn dữ liệu, với bề mặt đánh bóng điện ở Ra 0,4 μm hoặc thấp hơn, cánh quạt thủy lực cắt thấp, khả năng tuần hoàn, quản lý CO2 hòa tan và hệ thống điều khiển được xác nhận theo 21 CFR Phần 11 với dấu vết kiểm toán đầy đủ và chữ ký điện tử. Vỏ bình tương tự; nỗ lực kỹ thuật khác nhau một đến ba lần.

H: Tại sao công suất trên một đơn vị thể tích lại thấp hơn nhiều đối với nuôi cấy tế bào so với lên men vi sinh vật?

A: Bởi vì tế bào động vật thiếu thành tế bào và lớn hơn vi khuẩn khoảng 10-50 lần, khiến chúng dễ bị tổn thương hơn nhiều bởi cắt thủy động lực học và cắt do bong bóng gây ra. Tổn thương tế bào tương quan với tốc độ tiêu tán năng lượng rối cục bộ gần cánh quạt và với sự vỡ bong bóng tại giao diện khí-lỏng, chứ không phải với công suất đầu vào trung bình của bình. Hậu quả thực tế: bình vi sinh vật hoạt động 0,5-5 kW/m3, trong khi bình động vật có vú hoạt động 0,01-0,10 kW/m3, giảm 50 lần. Nhu cầu oxy tương ứng thấp hơn, do đó cường độ trộn giảm vẫn đáp ứng yêu cầu truyền khối. Việc tăng cường độ khuấy để giải quyết vấn đề trộn trong nuôi cấy tế bào gần như luôn gây hại nhiều hơn do ly giải tế bào so với giải pháp mà nó mang lại.

H: Bộ lên men tuần hoàn được tùy chỉnh khác với bình fed-batch như thế nào?

A: Bình tuần hoàn cần ba bổ sung. Thứ nhất, một vòng giữ tế bào: các đầu nối bổ sung cho mạch lọc dòng tiếp tuyến xen kẽ hoặc dòng tiếp tuyến, một bơm thu hoạch cắt thấp và một đường lọc đến bộ thu xử lý xuôi dòng. Thứ hai, điều khiển mức dựa trên trọng lượng duy trì khối lượng bình không đổi trong khi thu hoạch được rút ra liên tục và môi trường mới được đưa vào, thường giữ mức trong phạm vi ±2%. Thứ ba, thời gian nuôi cấy kéo dài có nghĩa là tính toàn vẹn vô trùng phải được duy trì trong 30-60 ngày thay vì 10-20 ngày, điều này làm tăng yêu cầu đối với phớt, đầu nối vô trùng và kiểm tra tính toàn vẹn của bộ lọc, và yêu cầu hệ thống lấy mẫu và trao đổi môi trường được thiết kế cho các đợt sản xuất dài mà không bị vi phạm.

H: Tài liệu xác nhận nào nên đi kèm với bộ lên men GMP tùy chỉnh?

A: Yêu cầu một bộ đầy đủ: bằng chứng đủ điều kiện thiết kế bao gồm bản vẽ, P&ID, chứng chỉ vật liệu theo EN 10204 3.1, báo cáo hoàn thiện bề mặt và tài liệu hàn với quy trình, chứng chỉ thợ hàn, bản đồ hàn và hồ sơ kiểm tra bằng nội soi. Hỗ trợ đủ điều kiện lắp đặt bao gồm bản vẽ hoàn công, chứng chỉ hiệu chuẩn thiết bị đo có thể truy xuất nguồn gốc đến các tiêu chuẩn quốc gia, xác minh tiện ích và hồ sơ bôi trơn. Hỗ trợ đủ điều kiện vận hành bao gồm các giao thức và kết quả kiểm tra chấp nhận tại nhà máy, xác minh vòng lặp điều khiển, kiểm tra báo động và khóa liên động, kiểm tra phạm vi CIP và dữ liệu giữ vô trùng. Bổ sung tài liệu phần mềm bao gồm đặc tả chức năng, đặc tả thiết kế và các giao thức thử nghiệm nơi nhà cung cấp cung cấp hệ thống điều khiển, cộng với các khuyến nghị về phụ tùng và bảo trì.