Opzioni di progettazione, materiali e controllo

Cos'è un bioreattore personalizzato e in che modo la personalizzazione differisce per la coltura cellulare rispetto al lavoro microbico?Un bioreattore personalizzato per la coltura cellulare è progettato attorno a quattro vincoli che non hanno molta importanza nella fermentazione microbica: estrema sensibilità al taglio, bassa domanda di ossigeno per unità di volume,controllo fisiologico rigorosoLe cellule dei mammiferi sono danneggiate a velocità superiori a circa 1,5 m/s, quindi le navi utilizzano albero di grande diametro ad ingresso di potenza di 0,01-0.10 kW/m3 anziché 0.5-5 kW/m3 tipici del servizio microbico. L'ossigeno disciolto è mantenuto al 20-50% della saturazione dell'aria, pH 6,8-7,4 entro ±0.05, temperatura 36,5-37,0°C e CO2 disciolto al di sotto di 100-150 mmHg.

1Opzioni di progettazione per colture sensibili al taglio e ad alta densità

La personalizzazione per la coltura cellulare si concentra su quattro sottosistemi, ognuno dei quali ha un obiettivo misurabile e una modalità di guasto definita:

• Agitazione e trasferimento di gas a basso taglio:La selezione dell'impellatore è dominante: un albero ad albero assiale di grande diametro o un'elica marina a D/T di 0,40-0,50 forniscono una miscelazione a granello ad una velocità di punta di 0,5-1,5 m/s,rispetto ai 3-7 m/s tollerati dai batteri e dai lievitiPoiché la domanda di ossigeno è inferiore, in genere da 0,5-2 mmol di O2/L·h anziché da 50-150, è sufficiente un sparger ad anello a 0,01-0,10 vvm.e il danno cellulare indotto da bolle all'interfaccia gas-liquido diventa il meccanismo limitante piuttosto che il taglio di massaL'aggiunta di 0,5-2,0 g/l di Pluronic F-68 protegge le cellule dalla rottura della bolla e l'uso di uno sparger a buco perforato anziché uno sinterizzato mantiene la dimensione della bolla abbastanza grande da ridurre il taglio interfaciale.
• Finitura superficiale e materiale:I recipienti di coltura cellulare sono costruiti in 316L a basso tenore di carbonio e con zolfo controllato, lucidati meccanicamente ed elettropulizzati a Ra 0,4 μm o inferiore per ASME-BPE SF4 o migliore.L'elettropolizia è importante per due motivi oltre alla pulizia.: rimuove le micro-fessure in cui i micoplasmi e i batteriofagi possono sopravvivere tra le campagne,e produce uno strato passivo arricchito di cromo che resiste ai ripetuti cicli caustici e acidi di un impianto multiprodottoQuando vengono utilizzati mangimi contenenti cloruri o mezzi ad alta salinità, si sostituisce il duplex 2205 o il 904L e tutti gli elastomeri devono essere di classe USP VI e privi di componenti di origine animale.
• Perfusione e ritenzione cellulare:I processi ad alta densità spingono oltre il batch alimentato raccogliendo continuamente mantenendo le cellule.Un bioreattore a perfusione personalizzato integra un flusso tangenziale alternato o un circuito di filtrazione a flusso tangenziale con un dispositivo di ritenzione destinato al pieno tasso di raccoltaLa velocità di perfusione specifica è tipicamente di 0,02-0,10 nL/cellula/giorno, equivalente a 1-3 volumi di vasi al giorno, mantenendo densità cellulari vitali di 20-80 x 10^6 cellule/ml a una vitalità superiore al 90%.Il recipiente richiede ugelli aggiuntivi per il circuito di ritenzione, una pompa di raccolta con testa di taglio bassa e una logica di controllo che mantiene costante il peso del recipiente mentre il prodotto viene prelevato.
• Gestione del CO2 disciolto:Ad alta densità cellulare, l'anidride carbonica disciolta si accumula e inibisce la crescita e la glicosilazione al di sopra di circa 100-150 mmHg.La personalizzazione affronta questo problema attraverso una maggiore velocità di spargimento di aria o ossigeno alla base del recipiente per eliminare la CO2, una maggiore apertura del fondo che aumenta il tempo di permanenza del gas, o un circuito esterno con un contattore a membrana.la risposta corretta è di solito più gas a bassa agitazione, che è una decisione di progettazione che deve essere presa quando la geometria della nave è fissata piuttosto che durante la messa in servizio.

2Architettura di controllo e conformità

Per i prodotti regolamentati, il sistema di controllo è un prodotto di conformità tanto quanto il recipiente.

• Strumentazione e PAT:I cicli standard coprono temperatura, pH, DO, pressione, livello e flusso di gas, con controllo in cascata del DO attraverso l'agitazione, quindi il flusso di gas, quindi l'arricchimento dell'ossigeno.Installazioni avanzate aggiungono misurazione della capacità per il volume di cella vitale in linea, spettroscopia di Raman per il glucosio, il lattato, il glutammato e il titolo, e analisi dei gas di scarico per OUR e CTR.Questi strumenti tecnologici di analisi dei processi supportano i test di rilascio in tempo reale nel quadro QbD definito da ICH Q8 a Q11, e spostano il controllo da punti di riferimento fissi a un'alimentazione basata su un modello che si adatta allo stato metabolico effettivo della coltura.
• Struttura della ricetta e integrità dei dati:Il software di controllo deve seguire l'ISA-88, separando la ricetta generale, la ricetta del sito, la ricetta principale,e la ricetta di controllo in modo che un processo definito a scala di laboratorio trasferisce alla produzione senza riscrivere la logicaPer la produzione GMP negli Stati Uniti, 21 CFR Parte 11 richiede software convalidato con tracce di audit sicure, generate da computer, timestampate, controlli di autorità attraverso l'accesso basato su ruoli,e firme elettroniche legate ai loro registriNell'Unione europea, l'allegato 11 impone requisiti equivalenti e entrambi richiedono che il sistema sia formalmente convalidato con prove documentate rispetto a una specifica scritta.
• Ibridi monouso e inossidabili:La personalizzazione significa sempre più scegliere dove mettere il confine tra riutilizzabile e usa e getta.Un impianto ibrido conserva il contenitore inossidabile per il bioreattore di produzione utilizzando sacchi monouso per la preparazione dei media, tenuta tampone e raccolta, che elimina il maggiore carico di convalida di pulizia mantenendo la capacità di pressione e il trasferimento di calore dell'acciaio.Treni completamente monouso adatti alla fabbricazione clinica multiprodotto inferiore a 2La scelta dovrebbe essere determinata dal numero di campagne e dalla frequenza di cambio: al di sopra di circa otto o dieci cambi di prodotto all'anno, l'uso singolo di solito vince sul costo totale delle merci.

Priorità personalizzate dei bioreattori per tipo di cellula

Domande frequenti (FAQ)

D: Qual è la differenza tra un bioreattore personalizzato e un fermentatore personalizzato?

R: In pratica la differenza è la banda di tolleranza e il carico di documentazione.e costi di capitale, con finitura superficiale intorno a Ra 0,8 μm, sigilli meccanici e strumentazione industriale.Un bioreattore personalizzato per la coltura di mammiferi o cellule staminali è ottimizzato per il controllo fisiologico e l'integrità dei dati, con superfici elettrolittrate a Ra 0,4 μm o inferiore, motori ad idrofilo a basso taglio, capacità di perfusione, gestione della CO2 disciolta,e un sistema di controllo convalidato secondo il 21 CFR parte 11 con traccia di audit completa e firme elettronicheIl guscio della nave è simile; lo sforzo di ingegneria differisce di un fattore da due a tre.

D: Perché la potenza per volume è molto più bassa per la coltura cellulare che per la fermentazione microbica?

R: Perché le cellule animali non hanno una parete cellulare e sono circa 10-50 volte più grandi dei batteri, rendendole molto più vulnerabili al taglio idrodinamico e indotto da bolle.Il danno delle celle è correlato al tasso di dissipazione locale dell'energia turbolenta vicino alla girante e alla rottura della bolla all'interfaccia gas-liquidoLa conseguenza pratica è che i vasi microbici hanno una potenza di 0,5-5 kW/m3, mentre i vasi mammiferi hanno una potenza di 0,01-0,10 kW/m3, una riduzione di 50 volte.La domanda di ossigeno è corrispondentemente inferiore, quindi l'intensità di miscelazione ridotta soddisfa ancora il requisito di trasferimento di massa.Spingere l' agitazione più in alto per risolvere un problema di miscelazione in coltura cellulare quasi sempre causa più danni attraverso la lisi cellulare di quanto non risolva.

D: In che modo un bioreattore a perfusione è personalizzato in modo diverso da un recipiente a batch alimentato?

R: Un recipiente di perfusione ha bisogno di tre aggiunte. Primo, un circuito di ritenzione delle cellule: ugelli extra per il flusso tangenziale alternato o il circuito di filtrazione del flusso tangenziale, una pompa di raccolta a basso taglio,e una linea di filtrazione per la cattura a valleIn secondo luogo, il controllo del livello basato sul peso che mantiene costante la massa del recipiente mentre la raccolta viene continuamente prelevata e il mezzo fresco viene alimentato, in genere mantenendo il livello entro il ± 2%.la durata prolungata della coltura significa che l'integrità sterile deve essere mantenuta per 30-60 giorni anziché 10-20, che aumenta le specifiche relative alle guarnizioni, ai connettori sterili e ai test di integrità dei filtri e richiede sistemi di campionamento e di scambio di media progettati per lunghe campagne senza violazioni.

D: Che documentazione di convalida deve accompagnare un bioreattore GMP personalizzato?

R: richiedere un pacchetto completo: prove di qualificazione del progetto, compresi disegni, P&ID, certificati di materiali secondo la norma EN 10204 3.1, relazioni di finitura superficiale e documentazione di saldatura con procedure, qualifiche del saldatore, mappa di saldatura e registri di ispezione boroscopica.certificati di taratura dello strumento riconducibili alle norme nazionaliIl supporto alle qualifiche operative comprende i protocolli e i risultati dei test di accettazione di fabbrica, la verifica del circuito di controllo, i test di allarme e di interlock,Prova di copertura CIPAggiungere la documentazione software, comprese le specifiche funzionali, le specifiche di progettazione e i protocolli di prova, se il fornitore fornisce il sistema di controllo;più ricambi e raccomandazioni di manutenzione.