Что такое кастомизированные биореакторы? Варианты дизайна, материалы и управление

Что такое кастомизированный биореактор и чем кастомизация отличается для культивирования клеток от микробного производства? Кастомизированный биореактор для культивирования клеток разрабатывается с учетом четырех ограничений, которые практически не имеют значения при микробной ферментации: чрезвычайная чувствительность к сдвигу, низкая потребность в кислороде на единицу объема, строгий физиологический контроль и полная целостность данных. Клетки млекопитающих повреждаются при скорости кончиков импеллера выше примерно 1,5 м/с, поэтому в аппаратах используются осевые гидрофойлы большого диаметра при мощности 0,01-0,10 кВт/м³, а не 0,5-5 кВт/м³, типичные для микробного производства. Растворенный кислород поддерживается на уровне 20-50% от насыщения воздухом, pH в пределах 6,8-7,4 с точностью до ±0,05, температура 36,5-37,0 °C, а растворенный CO₂ ниже 100-150 мм рт. ст.

1. Варианты дизайна для чувствительных к сдвигу культур и культур высокой плотности

Кастомизация для культивирования клеток сосредоточена на четырех подсистемах. Каждая имеет измеримую цель и определенный режим отказа:

• Низкосдвиговое перемешивание и газоперенос: Выбор импеллера имеет первостепенное значение. Осевой гидрофойл большого диаметра или гребной винт при соотношении D/T 0,40-0,50 обеспечивают объемное перемешивание при скорости кончиков 0,5-1,5 м/с по сравнению с 3-7 м/с, допустимыми для бактерий и дрожжей. Поскольку потребность в кислороде ниже, обычно 0,5-2 ммоль O₂/л·ч вместо 50-150, достаточно кольцевого барботера при скорости 0,01-0,10 vvm, а повреждение клеток, вызванное пузырьками на границе раздела газ-жидкость, становится лимитирующим механизмом, а не объемный сдвиг. Добавление 0,5-2,0 г/л Pluronic F-68 защищает клетки от разрыва пузырьков, а использование барботера с отверстиями вместо спеченного поддерживает достаточный размер пузырьков для снижения сдвига на границе раздела.
• Обработка поверхности и материал: Аппараты для культивирования клеток изготавливаются из стали 316L с низким содержанием углерода и контролируемым содержанием серы, механически полируются и электрополируются до Ra 0,4 мкм или ниже в соответствии со стандартом ASME-BPE SF4 или лучше. Электрополировка важна здесь по двум причинам, помимо простоты очистки: она удаляет микрощели, где микоплазмы и бактериофаги могут выживать между кампаниями, и создает обогащенный хромом пассивный слой, устойчивый к многократным циклам обработки каустиком и кислотой на многопродуктовом предприятии. При использовании сред, содержащих хлориды, или сред с высокой соленостью, используется дуплексная сталь 2205 или 904L, а все эластомеры должны соответствовать USP Class VI и не содержать компонентов животного происхождения.
• Перфузия и удержание клеток: Процессы с высокой плотностью клеток выходят за рамки периодического культивирования с подпиткой за счет непрерывного сбора продукта при удержании клеток. Кастомизированный перфузионный биореактор интегрирует петлю альтернативного тангенциального потока или тангенциальной фильтрации с устройством удержания, рассчитанным на полную скорость сбора. Удельная скорость перфузии обычно составляет 0,02-0,10 нл/клетку/день, что эквивалентно 1-3 объемам аппарата в день, поддерживая жизнеспособную плотность клеток 20-80 x 10^6 клеток/мл при жизнеспособности выше 90%. Аппарат требует дополнительных штуцеров для петли удержания, насоса для сбора продукта с низкосдвиговой головкой и логики управления, которая поддерживает постоянный вес аппарата при отборе продукта.
• Управление растворенным CO₂: При высокой плотности клеток накапливается растворенный углекислый газ, который ингибирует рост и гликозилирование при концентрации выше примерно 100-150 мм рт. ст. Кастомизация решает эту проблему за счет увеличения скорости барботирования воздуха или кислорода у основания аппарата для удаления CO₂, увеличения зазора между дном и поверхностью для увеличения времени пребывания газа или использования внешней петли с мембранным контактным устройством. Поскольку простое увеличение перемешивания повышает сдвиг, правильным решением обычно является увеличение подачи газа при меньшем перемешивании, что является проектным решением, которое должно быть принято при фиксации геометрии аппарата, а не во время ввода в эксплуатацию.

2. Архитектура управления и соответствие требованиям

Для регулируемых продуктов система управления является таким же элементом соответствия, как и сам аппарат. Она определяется тремя уровнями:

• Приборы и PAT: Стандартные контуры охватывают температуру, pH, DO, давление, уровень и расход газа, с каскадным управлением DO через перемешивание, затем расход газа, затем обогащение кислородом. В усовершенствованных установках добавляются емкостные датчики для определения объема жизнеспособных клеток в режиме реального времени, рамановская спектроскопия для определения глюкозы, лактата, глутамата и титра, а также анализ отходящих газов для определения OUR и CTR. Эти инструменты технологии анализа процессов поддерживают тестирование для выпуска в реальном времени в рамках концепции QbD, определенной в ICH Q8-Q11, и смещают управление с фиксированных уставок на модельное питание, адаптирующееся к фактическому метаболическому состоянию культуры.
• Структура рецептуры и целостность данных: Программное обеспечение управления должно соответствовать стандарту ISA-88, разделяя общую рецептуру, рецептуру предприятия, мастер-рецептуру и рецептуру управления, чтобы процесс, определенный в лабораторном масштабе, мог быть перенесен на производство без переписывания логики. Для производства в соответствии с GMP в США, 21 CFR Part 11 требует валидированного программного обеспечения с безопасными, генерируемыми компьютером, хронометрированными журналами аудита, проверкой полномочий через доступ на основе ролей и электронными подписями, связанными с записями. В Европейском Союзе Приложение 11 устанавливает эквивалентные требования, и оба требуют, чтобы система была формально валидирована с документированным тестированием в соответствии с письменной спецификацией.
• Одноразовые против нержавеющей стали гибрид: Кастомизация все чаще означает выбор места размещения границы между многоразовым и одноразовым оборудованием. Гибридное предприятие сохраняет аппарат из нержавеющей стали для производственного биореактора, используя при этом одноразовые мешки для приготовления сред, хранения буферов и сбора продукта, что снимает основную нагрузку по валидации очистки, сохраняя при этом прочность и теплопередачу стали. Полностью одноразовые линии подходят для многопродуктового клинического производства объемом до 2000 л. Выбор должен определяться количеством кампаний и частотой смены продукта: при более чем примерно восьми-десяти сменах продукта в год одноразовое оборудование обычно выигрывает по общей стоимости продукции.

Приоритеты кастомизированных биореакторов по типам клеток

Часто задаваемые вопросы (FAQ)

В: В чем разница между кастомизированным биореактором и кастомизированным ферментером?

О: На практике разница заключается в диапазоне допуска и объеме документации. Кастомизированный ферментер для производства пива, этанола или ферментов оптимизирован для производительности, простоты очистки и капитальных затрат, с обработкой поверхности около Ra 0,8 мкм, механическими уплотнениями и промышленными приборами. Кастомизированный биореактор для культивирования клеток млекопитающих или стволовых клеток оптимизирован для физиологического контроля и целостности данных, с электрополированными поверхностями Ra 0,4 мкм или ниже, низкосдвиговыми гидрофойльными импеллерами, возможностью перфузии, управлением растворенным CO₂ и системой управления, валидированной по 21 CFR Part 11 с полным журналом аудита и электронными подписями. Корпус аппарата схож; объем инженерных работ отличается в два-три раза.

В: Почему мощность на единицу объема для культивирования клеток намного ниже, чем для микробной ферментации?

О: Поскольку животные клетки не имеют клеточной стенки и примерно в 10-50 раз крупнее бактерий, они гораздо более уязвимы к гидродинамическому сдвигу и сдвигу, вызванному пузырьками. Повреждение клеток коррелирует с локальной скоростью диссипации турбулентной энергии вблизи импеллера и с разрывом пузырьков на границе раздела газ-жидкость, а не с мощностью, усредненной по аппарату. Практическое следствие: микробные аппараты работают с мощностью 0,5-5 кВт/м³, в то время как аппараты для млекопитающих работают с мощностью 0,01-0,10 кВт/м³, что на 50% меньше. Потребность в кислороде соответственно ниже, поэтому сниженная интенсивность перемешивания по-прежнему удовлетворяет требованию массопереноса. Увеличение скорости перемешивания для решения проблемы перемешивания при культивировании клеток почти всегда наносит больше вреда из-за лизиса клеток, чем решает.

В: Чем перфузионный биореактор отличается от периодического аппарата с подпиткой?

О: Перфузионный аппарат требует трех дополнений. Во-первых, петля удержания клеток: дополнительные штуцеры для контура альтернативного тангенциального потока или тангенциальной фильтрации, насос для сбора продукта с низким сдвигом и линия фильтрата для последующей обработки. Во-вторых, контроль уровня по весу, который поддерживает постоянную массу аппарата при непрерывном отборе продукта и подаче свежей среды, обычно поддерживая уровень в пределах ±2%. В-третьих, увеличенная продолжительность культивирования означает, что стерильная целостность должна сохраняться в течение 30-60 дней вместо 10-20, что повышает требования к уплотнениям, стерильным разъемам и тестированию целостности фильтров, а также требует систем отбора проб и обмена средой, разработанных для длительных кампаний без нарушений.

В: Какая документация по валидации должна сопровождать кастомизированный биореактор GMP?

О: Запросите полный пакет: доказательства квалификации проектирования, включая чертежи, P&ID, сертификаты материалов по EN 10204 3.1, отчеты о шероховатости поверхности и документацию по сварке с процедурами, квалификацией сварщиков, картой сварных швов и записями бороскопической инспекции. Поддержка квалификации монтажа включает исполнительные чертежи, сертификаты калибровки приборов, прослеживаемые до национальных стандартов, проверку инженерных систем и записи о смазке. Поддержка квалификации эксплуатации включает протоколы и результаты заводских приемочных испытаний, проверку контуров управления, тестирование сигнализации и блокировок, тестирование покрытия CIP и данные о стерильном хранении. Добавьте документацию по программному обеспечению, включая функциональную спецификацию, спецификацию проектирования и протоколы испытаний, если поставщик предоставляет систему управления, а также рекомендации по запасным частям и техническому обслуживанию.