Что такое биореактор для культивирования клеток? Принципы, типы и применение

Ответ на основной вопрос: Что такое биореактор для культивирования клеток и как он поддерживает жизнеспособность клеток млекопитающих при высокой плотности для производства биофармацевтических препаратов? Биореактор для культивирования клеток — это биореактор, специально разработанный и оптимизированный для культивирования клеток млекопитающих (таких как клетки китайского хомячка [CHO], NS0 или HEK293) или клеток насекомых в строго контролируемых условиях температуры (36,5–37,5 °C), растворенного кислорода (20–60% насыщения воздухом), pH (6,8–7,4) и осмоляльности (280–340 мОсм/кг). В отличие от микробных ферментеров, работающих при высоких скоростях перемешивания и высоких скоростях массопереноса кислорода, биореакторы для культивирования клеток должны поддерживать мягкие условия перемешивания, чтобы избежать повреждения клеток, вызванного сдвиговыми напряжениями, при этом обеспечивая адекватную доставку кислорода и питательных веществ.

1. Основные принципы работы биореакторов для культивирования клеток

· **Конструкция с низким сдвиговым усилием** Клетки млекопитающих не имеют жесткой клеточной стенки и повреждаются сдвиговыми напряжениями, превышающими 200–300 дин/см². В биореакторах для культивирования клеток используются импеллеры большого диаметра (соотношение D/T 0,4–0,6), работающие на низких скоростях (20–150 об/мин), обычно осевого типа (импеллер типа «морской винт», импеллер типа «ухо слона»), которые создают средние скорости сдвига 30–100 с⁻¹ при поддержании адекватного массопереноса кислорода (kLa 2–15 ч⁻¹).

· **Контроль растворенного кислорода** Клетки млекопитающих потребляют кислород со скоростью 0,5–5 × 10⁻¹² моль/клетку/час. При плотности клеток 10–30 × 10⁶ клеток/мл потребность в кислороде составляет 5–50 ммоль/л/час. Кислород подается путем барботирования (прямое добавление газа), аэрации поверхности или мембранной диффузии. Уровень растворенного кислорода поддерживается на уровне 20–60% насыщения воздухом с помощью каскадной системы управления, которая регулирует скорость и состав газового потока (воздух, O₂, N₂, CO₂).

· **Перфузия и удержание клеток** Перфузионное культивирование клеток непрерывно подает свежую среду и удаляет отработанную среду, удерживая клетки внутри биореактора с помощью устройства удержания клеток (фильтр с переменным тангенциальным потоком [ATF], фильтр-центрифуга или акустический сепаратор). Это позволяет достичь плотности клеток 50–200 × 10⁶ клеток/мл — в 10–50 раз выше, чем при периодическом культивировании с подпиткой — что обеспечивает в 10 раз более высокую объемную продуктивность в биореакторе меньшего размера.

2. Основные типы биореакторов для культивирования клеток

· **Биореактор с перемешивающим устройством** Система из нержавеющей стали (316L) или одноразовый пакет (объемом 50–2000 л) с нижним магнитным или механическим мешальным устройством. Отраслевой стандарт для клинического и коммерческого производства биофармацевтических препаратов. Оснащен многопараметрическим контролем (DO, pH, температура, анализаторы глюкозы/лактата) и возможностью CIP/SIP (для нержавеющей стали) или гамма-облученные пакеты (одноразовые).

· **Биореактор с волновым перемешиванием** Гибкий пакет на качающейся платформе, которая обеспечивает перемешивание и аэрацию за счет волнового движения без использования импеллеров. Мягкое движение (угол качания 6–10°, частота 15–35 об/мин) создает низкое сдвиговое напряжение (50–150 с⁻¹), что идеально подходит для клеток, чувствительных к сдвигу, и культур с низкой плотностью. Объемы от 10 мл до 600 л, в основном используются для расширения посевного материала и на ранних стадиях разработки.

· **Биореактор с полыми волокнами** Картридж, содержащий тысячи полупроницаемых полых волокон (размер пор 0,2 мкм, площадь поверхности 1–10 м²). Клетки растут на внешней стороне волокон при плотности до 1–5 × 10⁸ клеток/мл, в то время как среда протекает через просвет волокон, доставляя питательные вещества и удаляя отходы. Используется для долговременного (30–60 дней) непрерывного производства моноклональных антител и рекомбинантных белков в малых объемах.

Сравнительная таблица типов биореакторов для культивирования клеток

Часто задаваемые вопросы (FAQ)

Почему биореакторы для культивирования клеток должны работать при более низком сдвиговом напряжении, чем микробные ферментеры?

Клетки млекопитающих не имеют жесткой пептидогликановой клеточной стенки, что делает их восприимчивыми к повреждениям от сдвиговых сил кончиков импеллеров, разрыва газовых пузырьков и турбулентности потока. Сдвиговые напряжения выше 200–300 дин/см² вызывают разрыв клеточной мембраны и высвобождение внутриклеточных ферментов. Микробные клетки (бактерии, дрожжи) выдерживают в 10–100 раз более высокие сдвиговые нагрузки, поскольку их клеточные стенки обеспечивают структурную жесткость.

Что такое перфузионное культивирование клеток и чем оно отличается от периодического культивирования с подпиткой?

При периодическом культивировании с подпиткой питательные вещества добавляются периодически, а культура остается в биореакторе до сбора урожая (обычно 10–14 дней), достигая плотности клеток 10–30 × 10⁶ клеток/мл. При перфузионном культивировании свежая среда непрерывно подается, в то время как отработанная среда непрерывно удаляется, а клетки удерживаются фильтром или сепарационным устройством, поддерживая плотность клеток 50–200 × 10⁶ клеток/мл в течение 30–60 дней с объемной продуктивностью в 5–10 раз выше.

Каково требование к kLa для культивирования клеток млекопитающих?

Клетки млекопитающих требуют скорости массопереноса кислорода (kLa) 2–15 ч⁻¹, в зависимости от плотности клеток и метаболической активности. Это значительно ниже, чем при микробной ферментации (kLa 50–300 ч⁻¹), поскольку клетки млекопитающих имеют более низкие удельные скорости потребления кислорода (0,5–5 × 10⁻¹² моль/клетку/час против 10–100 × 10⁻¹² моль/клетку/час для бактерий).

Можно ли использовать биореакторы для культивирования клеток для производства вирусных вакцин?

Да. Клетки млекопитающих (Vero, MDCK, HEK293), культивируемые в биореакторах с перемешивающим устройством (50–2000 л), являются стандартной платформой для производства вирусных вакцин. Клетки заражаются вирусом (гриппа, полиомиелита, бешенства), который реплицируется внутри клеток. После заражения (3–7 дней) вирус собирают, очищают и инактивируют. Одноразовые биореакторы доминируют в этом применении из-за требований к биологической безопасности.